| 식물 유전체 연구에서 Bacterial Artificial Chromosome Library의 활용과 전망 김 신 제 / 책임연구원 서울대학교 식물분자유전육종연구센터 Tel. 031-290-2769 Fax. 031-296-2768 E-mail. sjekim@plaza1.snu.ac.kr 생명공학 산업은 IT 산업과 함께 21세기 들어 국내외의 정부 및 산업체에서 막대한 투자를 하고있는 중요한 핵심산업이다. 세계적으로 정보화산업의 발달은 Bioinformatics 산업에 놀라운 발전을 유도하였고, 유전체 연구를 가속화하였다. 유전체 연구란 유전자에 관련된 염기서열의 결정, 유전자 구조, 유전자 지도 작성 및 그 기능 분석 등을 포함하는 아주 포괄적이고 광대한 연구범위를 일컫는 말이다. 최근에 인체 유전체 연구는 선진국을 중심으로 9개국 24개의 연구센터가 참여하여 2003년까지는 인체유전자 염기서열 분석 완료를 목표로 현재 95%의 완성율을 자랑하고 있다. 이러한 유전체 연구와 정보화 산업의 만남은 인체를 비롯한 여러 종류의 생물의 유전자의 염기 서열 및 구조를 빠른 시간에 분석할 수 있는 많은 program의 개발을 가져왔다. 식물의 경우, 2000년 Arabidopsis와 벼의 유전자 염기서열을 완전히 밝혀 Post-Genome 시대의 막을 올렸다. 위와 같은 유전체 연구에 있어서 빠른 유전자 염기서열의 분석을 가져올 수 있었던 중요한 도구중의 하나가 Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Library의 개발이다. BAC이란 yeast chromosome library와 마찬가지로 100 kb 이상의 큰 유전자 절편을 삽입할 수 있으며 YAC은 이 절편이 blunt end ligation으로 삽입되어지나, BAC의 경우는 sticky end ligation이므로 DNA의 재조환율이 상당히 낮다. 또한 대장균내에 plasmid 형태로 존재하기 때문에 그 삽입된 DNA의 preparation이 용이하므로 여러 가지 분자 생물학 또는 유전학에 응용이 용이하다. 1. 국내외 연구동향 국외 연구동향을 보면 1994년도에 Rod Wing박사가 Human BAC library 기술을 수수에 이용하여 식물에 처음 도입하여 발표 (Woo et al., 1994)하였다. 미국내의 대표적인 BAC Center로는 Texas A&M의 TAMU와 Clemson University의 GUGI를 들 수 있다. 이 두 센터는 여러 종류의 BAC library를 제작하여 보유하는 한편 의뢰받은 BAC library를 제작, 유전자의 screening하는 등의 서비스 기능도 갖추고 있다. 국내 식물체 BAC library 제작 현황을 보면 초기 국내 BAC library의 작성 기술을 도입, 하기 위해 많은 노력을 기울였고, 현재 선두주자를 달리고 있는 1) 농업 과학기술원의 김용환 박사팀이 배추, 고추 그리고 벼의 BAC library를 작성하여 보유하고 있으며 2) 서울대학교 식물분자유전육종연구센터가 고추의 역병 저항성 품종인 Mexican chili CM334 (Yoo et al., 2001)을 3) 충남대 원예학과 임용표 박사팀이 배추에 대한 BAC library를 보유하고 있다. 2. BAC library의 제작 BAC library의 제작은 먼저 식물체로부터 핵을 분리한 다음 적당한 제한효소로 잘라 high molecular DNA를 준비한다. 준비된 DNA를 Pulse Field Gel Electrophoresis를 통해 high molecular DNA를 separation시킨 후, 적당한 크기 약 150 kb 이상의 DNA를 elution하여 한번더 위의 step을 거쳐 high molecular DNA만 선발한다. 이 DNA 절편을 BAC vector에 ligation하여 대장균 host인 DH10B또는 DH5aα에 형질전환하여 library를 만든다. BAC vector로는 초기에 만들어진 pbeloBAC series와 pECSBAC4가 많이 사용되었으나, plasmid의 copy수가 1-2개 밖에 존재하지 않아 X-gal이 첨가된 배지 내에서 blue 와 white의 구분이 용이하지 않다. 최근에는 LacZ 부위가 mutation되어 blue 정도가 상당히 높아진 유전자를 이용한 새로운 vector인 pIndigoBAC이 개발되어 이용되고 있다 (Fig. 1). 현재 국내외 완성된 BAC library의 유용성을 검정하기 위하여 BAC library의 average size를 측정, mitochondria DNA 또는 chloroplast DNA의 오염정도, 1 copy 유전자의 선발 가능성 등을 측정한다. BAC library의 average size를 측정 (Fig. 2a)한 후, 삽입된 DNA가 오염되지 않은 핵 내의 genome인지 알기 위하여 southern blot analysis를 통하여 확인한다 (Fig. 2b). 이렇게 확인된 BAC library의 colony들을 384 well plate에 키워 -80℃에 저장하고 Filter를 만들어 screening 용으로 준비한다. BAC library의 colony 수와 식물체 genome size는 아주 중요한 연관관계가 있다. 표 1에서 보는 바와 같이 고추는 arabidopsis의 27배 배추는 5배 정도의 genome size를 가지고 있다. 즉, 고추는 genome의 10배를 cover하려면 27만개의 average 100 kb BAC이 완성되어야 한다. 10X cover되는 BAC library의 경우 1copy 유전자를 찾을 확률이 99%에 달한다. 현재 BAC library의 제작은 몇몇 그룹에 의하여 보편화 되어가는 상태이다. High molecular weight DNA를 준비하여 보내면 BAC library를 만들어 보내는 국내외 회사로는 Incyte, Bioneer 그리고 제노텍 등이 있다. 3. 유전체 연구에서 BAC library의 활용 유전체연구를 가속화시킨 여러 가지 요인 중에 최고의 역할을 담당하였던 것이 바로 BAC library이다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 BAC library는 Map-based cloning, BAC contigs를 이용한 Physical Mapping, BAC-FISH, BAC을 template로 이용한 Differential Display를 실시하여 발현 특이적 유전자 cloning, Comparative Genome Hybridization, 그리고 High molecular weight DNA transformation 등이 가능하다. 3-1. Map-based cloning 유전학자들에 의하여 오랫동안 연구되어진 특정형질에 대하여 그 표지 인자가 개발되어져 genetic map이 완성되어 왔다. 이들 map에 표식된 표지인자들을 이용하여 BAC library를 screening하고 유전자를 찾아 cloning하여 그 유전자의 기작을 연구하는데 이 BAC은 유용하게 이용된다. 그 예로 벼의 Xanthomonas 저항성 유전자인 Xa21 (Song et al., 1995), Tomato의 Pseudomonas 저항성인 Prf gene (Salmeron et al., 1996)들을 들 수 있다. 병 저항성인자 뿐만 아니라, 토마토의 fruit size를 결정하는 인자인 fw 2.2 (Frary et al., 2000) 나 아라비돕시스의 blue light receptor인 NPL1 gene (Kagawa et al.,2001) 등 많은 유전자가 이 기술을 이용하여 cloning되고 있다. 3-2. Physical Map (BAC contigs) Physical Mapping을 수행하는 방법은 여러 가지가 있다. 첫째, 유전자 지도가 작성되어 있는 경우는 그 유전자 지도에 표식된 인자의 BAC clone을 선발하여 physical mapping을 하는 것이 용이하다. 유전자 지도란, 교배조합을 만들고 이로부터 F2 population 또는 RIL population을 만들어 RFLP (Kang et al., 2001), AFLP 또는 SSR-based mapping (venter et al., 1997) 을 이용하여 그 유전자 표식을 만드는 것이다. 이러한 유전자지도에 표식된 인자들의 positive BAC clone을 선별 그 clone들을 나열하여 contig를 작성하는 것이다 (Meyer et al., 1998). 둘째, BAC-end sequencing (venter et al., 1996; boysen et al., 1997) 방법을 통하여 BAC clone들의 overlap되는 부분을 이용하여 contig를 작성 (Gillett et al., 1996; Soderlund et al., 1997)하는 것이다. 최근에는 high-throughput DNA fingerprinting (Marra et al., 1997)와 contig assembly (Ding 1999) 방법이 개발되어 아라비돕시스, 벼, 배추의 physical mapping이 진행되고 있다. 셋째, Fig. 4에서 보는 것과 같이 이미 알려진 유전자의 positive한 BAC clone을 선발하여 fluorescence in situ hybridization (FISH) (Cai et al., 1995; Hanson et al., 1995; Lapitan et al., 1997; Godard et al., 1999) 방법을 이용하여 chromosome 상에 그 유전자의 위치를 정하는 방법 (Peterson. 1999)이 있다. 즉 서로 다른 두 유전자의 순서를 centromere를 중심으로 하여 chromosome 상의 위치를 정할 수 있다. 3-3. BAC을 template로 이용한 Differential Display 이 방법은 아직 식물에서 그 결과나 분석이 발표되지 않았으나. 동물에서는 점차 그 방법이 널리 이용되어지고 있다. 실험방법을 요약하면 BAC library의 clone들 중 특정시간 또는 부위에서 발현하는 것을 찾아내는 것으로 BAC filter를 template로 특정시간 또는 부위에서 발현하는 mRNA를 probe로 하여 BAC clone를 screening하는 방법이다. 이 경우는 cDNA를 이용한 differential Display 방법과는 달리 특정부위, 특정시간에서 발현하는 유전자의 genomic DNA를 찾을 수 있는 강점을 가지고 있다. 한편, Microarray를 이용하여 각각의 BAC clone에 대한 expression profile을 작성할 수 있다. 3-4. DNA chip을 이용한 Comparative Genome Hybridization (CGH) 동물에서 C. elegance와 Mouse의 유전체 차이를 알아보기 위하여 실시한 연구로 둘 중 하나의 BAC clone을 이용한 DNA chip을 제작한 후, 그 나머지 genomic DNA로 hybridization을 실시하여 template genome상에 존재하지 않는 BAC clone를 분석하는 방법이다. 현재 미국에서 식물의 가지과에 속하는 감자, 고추, 그리고 토마토를 comparative mapping을 실시하는 과제의 일부로 Arabidopsis와 비교하는 comparative genomic hybridization을 실시할 계획이 있다. 3-5. High molecular weight DNA transformation BAC library에 평균 DNA insert size는 100kb 이상이다. 어떤 흥미있는 유전자의 BAC clone을 선발하였을 경우, 식물체에 형질전환하기 위하여 subcloning 이라는 단계를 거쳐야 한다. 이 단계를 거치는 동안 계속적인 선발이 이루어져야 하므로 많은 노동력과 시간을 필요로 한다. 이러한 step을 단축하기 위하여 Hemilton (1998) 등은 BIBAC system을 개발하였고 Choi (2000) 등은 site specific recombination을 이용한 BACwich system을 개발하였으나 그 이용이 효율적으로 이루어지지 않고 있다. 그러므로 새로운 vector의 개발이 요구된다. 4. 앞으로 BAC library의 전망 국내외 유전체사업의 중요도가 부각되면서 유전체 연구 사업에 있어 대규모의 BAC library construction이 이루어질 것으로 예상된다. 미생물과 같이 genome size가 작은 경우에는 shotgun library를 제작하여 Full genome을 sequencing하는 것은 가능하나 각각의 유전자를 cloning하고 shotgun library의 gap을 보완하기 위하여 BAC은 필수적이다. 식물 유전체연구의 경우 genome size가 크기 때문에 BAC library의 construction 후, contig 작성이 이루어져야 한다. 또한 거대유전자 형질전환 기술의 발달은 식물의 2차 대사 산물과 같이 하나의 유전자가 아닌 여러 가지 metabolic pathway에 관련된 gene cluster를 만들어 식물체에 도입하는 것이 가능할 것으로 사려된다. 식물분자육종이라는 프론티어 사업이 2001년 후반기에 시작되면서 이 기술은 분자육종에 중요한 도구로 사용되어 질 것이다. References 1. Boysen, C., Simon, M. I., and Hood, L. (1997) Fluorescence-based sequencing directly from bacterial and P1-derived artificial chromosomes. BioTechniques 23: 978-982. 2. Cai, L., Taylor, J. F., Wing, R. A., Gallagher, D. S., Woo, S.-S. and Davis, S. K. (1995) Construction and characterization of a bovine bacterial artificial chromosome library. Genomics 29: 413-425. 3. Eun Young Yoo, Shinje Kim, Joo-Yean Kim and Byung-Dong Kim. (2001) Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library from chili pepper. Mol Cel (in press) 4. Fray, A., Nesbitt, T. C., Grandillo, S., Knaap, E., Cong, B., Liu J., Meller, J., Elber, R., Alpert, K. B., and Tanksley, S. D. (2000) Fw2.2: a quantitative trait locus key to the evolution of tomato fruit size. Science 7: 289 (5476) 85-88 5. Gillett, W., Hanks, L., Wong, G. K.-S., Yu, J., Lim, R. and Olson, M. V. (1996) Assembly of high- resolution restriction maps based on multiple complete digests of a redundant set of overlapping clones. Genomics 33: 389-408. 6. Godard, S., Oustry-Vaiman, A., Cribiu, E. P. and GuXin, G. (1999) FISH mapping assignment of two horse BAC clones containing HMS41 and HTG3 microsatellites. Anim. Genet. 30: 233. 7. Hanson, R. E., Zwick, M. S., Choi, S., Islam-Faridi, M. N., McKnight, T. D., Wing, R. A., Price, H. J. and Stelly, D. M. (1995) Fluorescent in situ hybridizationof a bacterial chromosome. Genome 38: 646-651. 8. Kagawa, T., Sakai, T., Suetsugu, N., Oikawa, K., Ishiguro, S., Kato, T., Tabata, S., Okada, K., and Wada, M. (2001) Arabidosis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science 16: 291 (5511): 2138-2141. 9. Kang, B.C., Nahm, S.H., Huh, J.H., Yoo, H.S., Lee, M.H., Kim, B.D. (2001) Combined molecular linkage map construction using RFLP and AFLP in hot pepper. Theor. Appl. Genet. 10. Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L. and Knudson, D. L. (1997) FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11: 149-156. 11. Patocchi, A., Vinatzer, B. A., Gianfranceschi, L., Tartarini, S., Zhang, H.-B., Sansavini, S. and Gessler, C. (1999) Construction of a 550 kb BAC contig spanning the genomic region containing the apple scab resistance gene Vf. Mol. Gen. Genet. 262: 884-891. 12. Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Rommens, C. M., Scofield, S. R., Kim S. R., Lavelle, D. T., Dahlbeck, D., and Staskawicz. (1996) Tomato Prf is a member of leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell. 12: 86 (1): 123-133. 13. Song, W. Y., Wang, G. L., Chen, L. L., Kim, H. S., Pi, L. Y., Holsten, T., Gardner, J., Wang, B., Zhai, W. X., and Zhu, L. H. (1995) A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science 15: 270 (5243)1804-1806. 14. Venter, J. C., Adams, M. D., Sutton, G. G., Kerlavage, A. R., Smith, H. O. and Hunkapiller, M. (1998) Shotgun sequencing of the human genome. Science 280: 540-1542. 15. Woo, S.-S., Jiang, J., Gill, B. S., Paterson, A. H. and Wing, R. A. (1994) Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of Sorghum bicolor. Nucleic Acids Res. 22: 4922-4931. 저자약력 : 1994 서울대학교 식물분자유전학 박사 1995-1996 서울대학교 Institute of Agricultural Science & Development, 연구원 1996-1998 Department of Vegetable Crops, University of California, Davis 연구원 1999-현재 식물분자유전육종 연구센터 책임연구원 |
뉴스지 
02논단(김신제)9_13.pdf (890.1 KB / Down : 1139)
